在光的照射下，某些物质吸收光进入刺激状态。当从刺激状态回到基态时，吸收的光能可以以电磁辐射的形式释放。这种现象称为光致发光。在这种现象中，如果用短波长光照射物质，它可以在很短的时间内发出比照射光长的波长光，即荧光。荧光素是一些具有这种特性的染料。20世纪40年代，FITC异硫氰酸荧光素标记抗体检测可溶性肺炎球菌多糖抗原并取得成功。从那时起，创建了免疫荧光抗体标记技术。该技术将抗原抗体反应的高特异性与荧光的敏感性和可测性有机结合，可准确、特异、敏感、快速检测和定位未知和微量抗原。目前，它已广泛应用于生命科学研究的各个领域和学科。

　　FITC标记抗体的原理

　　FITC异硫氰酸荧光素是一种常用的标记抗体的方法。FITC一般为黄色。棕色或棕色粉末或结晶，在低温下可保存数年。在碱性条件下，FITC的碳酰胺键可与抗体蛋白上的赖氨酸氨基结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。抗体分子**可标记15~20个FITC分子。标记的抗体仍能保持与相应抗原结合的能力，在荧光源紫外线或蓝紫光的刺激下产生黄绿色荧光，通过荧光显微镜观察或使用流细胞仪进行分析，从而定性、定位或定量抗原。

　　FITC标记抗体方法

　　FITC抗体标记主要包括Marshall直接标记法.Chadwick间接标记法.改进标记法和透析法。

　　Marshall直接标记法

　　抗体准备:取纯化Ig溶液测量蛋白质含量，放入三角烧瓶中，加入生理盐水和0.5mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液，在冰箱中搅拌5~10min;

　　荧光素准备：按每毫克蛋白质加0.01~0.02mg的FITC计算，准确称为取后加入抗体溶液;

　　标记:搅拌时加入荧光素，避免粉末粘附在墙上，放入4℃冰箱或冰库继续搅拌12~18h;

　　透析:组合后，将组合物与3000r/min离心20min，去除少量沉淀物，放入透析袋中，然后放入pH8.0缓冲盐烧杯中透析一夜;

　　过柱：取透析过夜标记，过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离自由FITC，收集标记荧光抗体进行鉴定。

　　Chadwick间接标记法

　　抗体准备:0~4℃下，用0.01mol/LpH8.0PBS将待标记的抗体蛋白溶液稀释至30~40mg/ml，放入三角烧瓶中放入冰箱;

　　荧光素准备:按每毫克蛋白质加入0.01mg荧光素，溶解在等量3%重碳酸钠水溶液中;将抗体蛋白溶液等量与FITC溶液混合，在0~4℃搅拌18~24小时，充分搅拌;

　　透析或柱层分析

　　改良法

　　抗体准备:取纯化Ig溶液测量蛋白质含量，放入三角烧瓶中，加入生理盐水和0.5mol/LPH9.5碳酸盐缓冲液，在冰箱中搅拌5~10min;

　　荧光素准备：按每毫克蛋白质加0.01~0.02mg的FITC计算，准确称为取后加入抗体溶液;

　　标记:搅拌时加入荧光素，避免粉末粘附在墙上，放入4℃冰箱或冰库继续搅拌12~18h;

　　用半饱和硫酸铵将标记的抗体蛋白沉淀分离，3000r/min离心30min，将上清液中的游离荧光素倾倒，然后用缓冲盐水透析去除硫酸铵。将准备好的荧光抗体加入0.01%nan3，分装保存。

　　透析法

　　用0.025mol/LPH9.2碳酸盐缓冲液将待标记的抗体蛋白稀释成1%浓度，放入透析袋中;

　　FITC用同样的缓冲液制成0.1mg/ml溶液，放入圆形容器中，浸泡透析袋，4℃搅拌24h;

　　取出透析袋中的标记液。立即通过G-25或G-50柱葡聚糖凝胶，去除游离荧光素，收集荧光抗体进行鉴定。

　　荧光抗体质量控制

　　FITC抗体的质量鉴定，包括特异性和敏感性鉴定。

　　鉴定染色特异性和敏感性

　　特异性染色效率的测定:直接染色时，荧光抗体溶液以1:2.1:4.1:8的比例稀释，并与相应的抗原标本进行一系列染色。荧光强度在+++的**稀释度是荧光抗体的染色效率。如果染色效率为1:64，实际染色时可采用1:32或1:16。如果是间接染色效率测定，可以先用不同稀释度的荧光抗体染色。因此，以抗核抗体荧光强度++为标准

　　非特异性染色：根据荧光抗体的不同用途，类似的抗原切片或涂片可以稀释荧光抗体。根据常规染色步骤，标本上的非特异性染色应明显低于特异性染色滴度，否则荧光抗体应通过消除非特异性染色来处理;

　　吸收试验：在荧光抗体中加入过量的相应抗原，在室温下搅拌2小时，移入4℃中过夜，3000r/min，离心30min，收集清液，然后用相应的抗原阳性标本染色，结果不应有明显的阳性荧光。

　　F/P值测定

　　荧光抗体的鉴定一般采用荧光素(F)与抗体蛋白(P)的克分子比，即F/R值，反映荧光抗体的特异性染色质量。实验要求F/R比为1~2。当过高时，非特异性染色增强;当荧光太低时，荧光很弱，以降低敏感性。具体方法如下:

　　蛋白质定量：确定荧光抗体的蛋白质mg/ml;

　　制作荧光素定量标准曲线：将FITC1mg溶解在10ml0.5mol/lpH9.0碳酸盐缓冲液中，然后用0.01mol/lpH7.2PBS稀释到100ml，获得的荧光素含量为10ug/ml，并将9种不同浓度的溶液不同浓度的溶液。OD值用分光光度计在490nm波长中测量，标准函数图以光密度为纵坐标，荧光素含量为横坐标;

　　结合荧光素定量：荧光素与蛋白质结合后，其吸收光谱峰值向长波方向移动约5nm，读取值后可按公式计算。

　　FITC抗体标记注意事项

　　温度.时间.pH.荧光素和蛋白质量等都是影响标记效率的因素，需要控制;

　　荧光素及其标记抗体的操作过程应注意避光，搅拌速度应适当避免产生气泡;

　　注意正确操作，使柱体均匀.柱面平整，无气泡.裂缝;

　　上样和洗脱应为前切和后切。前切指柱顶缓冲液与凝胶平面相切时加样品，后切指样品与凝胶平面相切时加洗脱缓冲液。

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