DAF-FM DA（新一代用于一氧化氮定量检测的荧光探针）的使用方法使用方法

一、储存液制备

2.1   储存液制备

取低温保存的冻干粉置于室温回温至少20min，低速离心后，加入适量体积的无水DMSO配制成一定浓度的储存液。比如，往1mg DAF-FM DA（Mw：496.42）加入402.88μl DMSO，充分溶解后配制成5mM储存液。

2.2   储存液保存

为了延长储存液的保存时间，需根据单次用量分装避光冻存，以最小化反复冻融次数。分装冻存的溶液至少稳定保存6个月。

2.3   工作液制备

于正式实验前，用合适的生理缓冲液或新鲜培养基取适量储存液稀释到工作浓度。工作液需现配现用，多余的工作液需丢弃。建议起始工作浓度范围是1-10μM。

二、操作步骤

【注意】：以下操作步骤仅做参考。**的加载浓度、时间和温度需根据经验来调整。总的来说，以能达到检测需求的**浓度**。通过降低加载温度能减缓亚细胞区室化现象。

2.1 细胞悬液或玻片上准备活细胞；

2.2 用适当缓冲液或新鲜培养基（不含血清和酚红）稀释DMSO储存液。建议起始工作浓度范围是1-10μM。

2.3 用稀释好的DAF-FM DA工作液孵育细胞20~60min，孵育温度为4~37℃。贴壁细胞不需消化后再加载。

2.4 用PBS, pH 7.4充分清洗细胞直至去除多余探针。更换新鲜缓冲液或培养基再孵育15~30min，使得细胞内酯酶能将探针充分去酯化。

2.5 激发和发射波长分别是495和515nm。因这些波长与荧光素（fluorescein）非常相似，因此，适用于荧光素（fluorescein）或FITC的检测系统都行。

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小编zhn2021.11.23