荧光素/花菁Cy染料DNA与RNA核酸

荧光素（FAM）标记单链DNA(FAM-DNA)核酸探针：

MicroRNA（miRNA）是一类长约19至25个核苷酸的非编码小分子RNA，它在个体生物发育分化等生命活动中有着重要调节作用，并且miRNA的表达与癌症等重大疾病的发病密切相关，因此实现miRNA的灵敏检测具有重要的意义。有研究表明，氧化石墨烯（GO）能够**猝灭多种染料的荧光，并且具有优良的生物相容性、高吸附能力等优点，因此将GO作为荧光的猝灭基团，构建基于GO与染料（或染料标记的生物分子）之间的能量共振转移体系，已经成为荧光生物传感器领域的研究热点。

以荧光素（FAM）标记的单链DNA(FAM-DNA)作为核酸探针，加入GO后，由于FAM-DNA探针与GO之间存在较强的π-π堆积效应，因此FAM-DNA探针会迅速的吸附到GO的表面，FAM-DNA探针的荧光素基团与GO发生能量共振转移，导致FAM-DNA探针的荧光信号被完全猝灭；然而，加入目标分子miRNA时，FAM-DNA探针和目标分子通过碱基配对原则杂交形成稳定的双链结构，当GO存在时，由于双链核酸分子自身的双螺旋刚性结构，其与GO的结合能力**降低，不会被吸附在GO表面，从而可保持其荧光信号。荧光信号的强弱与体系中miRNA的浓度成正比，从而实现了miRNA的定量检测。　　

在此基础上，我们利用酶切放大机制来进一步提高该方法对miRNA检测的灵敏度。我们引入一种特异性双链核酸酶（DSN），DSN能够特异性切割完全匹配的DNA双链或者RNA与DNA完全匹配杂交双链中的DNA，对单链的DNA或者RNA无任何作用。在上述实验原理基础上，当目标分子miRNA与FAM-DNA探针杂交形成稳定的双链结构时，加入DSN酶，DSN酶切割杂交双链结构中的FAM-DNA探针，切碎后的荧光基团不能被GO吸附，同时目标分子miRNA被释放出来，再次与其它的FAM-DNA探针杂交，DSN酶再切割FAM-DNA探针，如此循环反复进行，实现了一个目标分子与多个FAM-DNA探针循环杂交、切割，大量的荧光基团被释放出来，体系的荧光信号被**放大，通过检测体系荧光信号的变化，实现了对miRNA的高灵敏度检测。该方法实验原理简单，背景干扰小，操作快速简单，可检测到低至60pM的目标分子miRNA。

Cy5标记核酸片段：

DNA疫苗是一种能够作为疫苗使用的DNA序列。这一序列来自于病原体，编码病原体的蛋白。将此序列克隆到真核表达载体上并将构建的重组质粒注入到宿主体内，并使外源基因得以表达，从而激活机体免疫系统，引发抗体反应，可以达到消灭病原体的目的。　　

**、特异地将DNA疫苗导入到抗原递呈细胞中并使它得到**表达是提高DNA疫苗免疫活性的根本途径。细菌菌蜕(bacterial ghost，BG)是使用裂解酶将细菌裂解、去除菌体内容物之后形成的空腔。BG周质腔内膜和外膜相互链接一个具有完整的细胞膜结构，可用于装载质粒DNA。BG还能够被宿主DC识别、吞噬，靶向性将DNA疫苗导入DC细胞，增强DNA疫苗的免疫活性。
　　以BG为载体制备双重靶向DNA疫苗：首先利用BG将DNA疫苗靶向性的导入树突状细胞(DC)、并获得**表达；其次将编码抗原的基因片段构建在Ii载体中，内源靶向性地将表达产物递交给MHC-Ⅱ分子，进一步提高抗原提呈能力和免疫应答水平。

1. 大肠杆菌ghost的制备及鉴定。
　　2.BG装载核酸片段和质粒DNA，并转染巨噬细胞RAW264.7
　　 将成功制备的BG与CY5标记的核酸片段按不同浓度混合、孵育，离心收集采用Mito Tracker将BG染色后，流式细胞术检测装载效率，发现在**条件下，95％的BG内均装载了的DNA片段。在此基础上装载PI染色的质粒pDSRed-N1，装载效率可达91.98％。将装载有质粒pDSRed-N1的菌蜕转染巨噬细胞RAW264.7，转染48h后采用激光扫描共聚焦显微镜观察RAW264.7细胞内吞BG的过程及Red基因的转染效率，发现在50-60％转染细胞中可同时观察到绿色荧光信号(即Mito Tracker标记的BG)和红色荧光信号(DsRed编码的红色荧光蛋白)。结果提示BG可发挥外源性靶向作用，**地将质粒DNA导入巨噬细胞(抗原提呈细胞)，并获得较高的表达水平。
　　3.FMDV内源性靶向DNA疫苗的构建
　  4.VP1抗原的表达和纯化
　　5.细胞转染和动物实验
　　以上结果初步证实，采用BG为载体或将DNA疫苗构建到内源性靶向载体上均可提高疫苗的免疫原性，而采用双重靶向载体技术可进一步提高DNA疫苗的免疫原性水平。采用本方法制备的疫苗还可以是多价的，首先若以BG装载2种或多种DNA疫苗，就对多种疾病产生免疫反应；其次若选取特定的致病性细菌制备BG，那么在使用疫苗之后，就可以在DNA疫苗发生作用的同时对特定的致病性细菌产生免疫保护作用。我们相信，随着双重靶向疫苗制备技术的完善，本研究策略有可能在未来的新型疫苗研究中发挥重要作用。

物：

异硫氰酸荧光素FITC、CY3、CY3.5、CY5、CY7、罗丹明等

单克隆抗体多克隆抗体或重组抗体

荧光修饰的多肽（各种序列号的多肽、靶向肽、穿膜肽、环肽、序列肽)

磷脂（DSPE、DOPE、DMPE、DPPE、DPG、DPPS等磷脂）

高分子聚合物的

单糖、多糖、聚糖、寡糖、脂多糖、琼脂糖/近红外

荧光定制标记药物、小分子、抑制剂、医药中间体、生物活性小分子

氨基酸及聚氨基酸的

DNA与RNA核酸

核酸及衍生物

核糖、核苷、核酸及其衍生物

核酸类药物（寡核苷酸、质粒DNA、siRNA等）

脂质体的

空白对照脂质体

载药脂质体

装载DNA或小分子脂质体

多室脂质体

多囊脂质体

免疫脂质体

热敏脂质体

PEG化的脂质体

配体靶向性脂质体

长循环脂质体

阳离子脂质体

荧光脂质体

中性脂质体

负电荷脂质体正电荷脂质体

磁性脂质纳米颗粒

载双药或者多药脂质体

酸敏脂质体

PLGA微球和纳米粒子

树状分子、脂质聚合物

冠醚、环糊精、葫芦脲、杯芳烃衍生物、卟啉、酞菁

各种细胞(干细胞、活细胞、细胞核）

碳水化合物的

酶与辅酶的（溶菌酶、过氧化物酶、脂肪酶）

碳纳米材料（碳纳米管、富勒烯、碳纳米角）

金属与陶瓷材料的

的微球-红色、橙色、绿色、蓝色、黄色、核酸、紫色

离子液体的

有机硅化合物（有机硅球、包裹Fe3O4硅球、介孔硅球、载药硅球）

金纳米粒子/银纳米粒子

二氧化硅纳米粒子/氧化铁纳米粒子

量子点

磷脂氨基酸的

可生物降解的聚合物

天然聚合物

嵌段共聚物

亲水聚合物

抗体磁珠的

超分子材料的

蛋白酶抑制剂的

杂环的

光电材料的（有机光电、电子材料、光电中间体、掺杂材料）

生物磁珠

造影剂的

代谢物

重组蛋白

生物大分子