1、氨基修饰介孔二氧化硅(NH2-MSN)的制备

  依据** Stober法制备MSN,在此基础上，本实验改良了** Stober 法，并一步合成NH2-MSN :1.0 g CTAB溶解于480 mL超纯水中,加入3.5 mL 2 mol.L-1NaOH 溶液,80℃恒温搅拌2 h，然后快速加入3 mL TEOS,30 min后缓慢恒速滴入2mL APTES,控制5 min 滴毕,恒温继续反应2 h,反应结束后静置熟化24 h, 15 000 r - min-1离心30min得到白色固体。将离心得到的白色固体分散于200 mL NH4NO3(10 mg .mL-')的乙醇溶液中80 ℃回流4 h,经过6次反复操作去除模板剂CTAB,最后一次离心后真空干燥,得到白色粉末NH,-MSN。采用透射电镜(TEM)分别对MSN、NH2-MSN进行观察，粒径仪测定粒径及Zeta 电位,傅立叶红外光谱仪(FTIR)表征. NH2-MSN 上的修饰氨基。

2、NH2-MSN-RES的制备

  本实验设计了反复饱和溶液吸附法来制备NH2 -MSN-RES:称取100 mg NH2-MSN(记为W10)分散到RES饱和乙醇溶液20 mL中,常温25℃避光搅拌,每隔30 min短时超声3 min,搅拌2h使 NH2-MSN充分吸附RES饱和乙醇溶液,然后15 000 r ·min-1离心30 min,将离心得到的白色固体35℃减压干燥后称重(记为W11)﹐然后重复分散、吸附﹑离心、干燥、称重,每重复一次的称重分别记为W12、W13、W14……。同样,称取100 mg NH2-MSN分散到乙醇溶液20 mL中,除了不加入RES 外,其他同法操作,每次称重分别记为W01、W02 、 W03、 W04……,按照相同的方法制备对照组MSN-RES。

3、NH2-MSN-RES体外释放度的测定

  称取RES、MSN-RES、NH2-MSN-RES适量(折合RES量10 mg)分散于10 mL的PBS(pH 7.4)缓冲液﹐置于透析袋(截留相对分子质量3500）中,透析夹密封后置于释放介质PBS 中,体积为1000 mL，在37℃下以50 r  min-1恒温水浴振荡,平行操作3份。分别于15、30、45、60 min、2、4、6、8、12、24、48 h取l mL透析介质,并补充相应的PBS。取出的透析介质用0.45 um微孔滤膜过滤,续滤液经 HPLC 测定RES浓度,计算累积释药百分率。

4、HPLC色谱条件

  色谱柱:SunFire C18 (4.6 mm x 250 mm,5 um);流动相:甲醇水(50:50);柱温:35℃;流速:1.0 mL·min-1 ;检测波长:306 nm;进样量:20 uL。以白藜芦醇的峰面积为纵坐标(Y),其浓度为横坐标(X)进行线性回归,得回归方程为:y=132 917X +776.27,r =0.999 9,表明RES在0.25 ~10 ug· mL-'内线性关系良好。考察其高、中、低3种浓度溶液的日内精密度RSD小于2%,日间精密度 RSD小于3%。

5、NH2-MSN 细胞毒性

  取对数生长期Caco-2细胞接种于96孔平底细胞培养板中,密度为1 x105个·mL-1每孔加入190uL培养液培养12 h。然后实验组分别加入不同溶度的MSN和NH2-MSN的混悬液10 uL,**质量浓度分别为0.01、0. 1、0.5、1、5、20、50、100 ug mL-1,空白对照组加入无菌生理盐水,每组每浓度设6个平行孔。培养 24 h后，每孔加入 5 mg ·mL-1的MTT溶液10 uL,微量振荡器上振荡3 ~5min,继续培养4 h,弃上清液,加入DMSO 150 uL,在微量振荡器上振荡10 min,用酶标仪测定570 nm波长处其光密度(A)值。取6个孔平均A值计算细胞的存活率(IC),IC=(实验组A 值/空白对照组A值)×**。

6、NH2-MSN-RES跨膜转运

  参考文献建立 Caco-2细胞单层模型。将造模成功的Transwell(美国Corning公司3402型,膜面积1.12 cm2,膜孔径3 um)小室置于12孔嵌套板中，每板分为3 组 ( RES、MSN-RES、NH2-MSN-RES),平行6孔,每组考察含RES为2 ug ·mL-1 3种制剂的转运情况。用预先37℃保温的D-Hanks溶液冲洗3次,跨膜转运AP侧→BL侧时,在 BL室加入1.5 mL空白D-Hanks溶液,使AP室外表面完全浸透,然后在AP室加入1.5 mL含药培养基;跨膜转运BL侧→AP侧时,在BL室中加入1.5 mL含药培养基，AP室加入1.5 mL空白D-Hanks溶液。加入药液后分别于0.5、1、2、4、8、12 h 时从BL或AP室小心取样0.15 mL,并补充0.15 mL的空白D-Hanks。样品经 HPLC测定**浓度,绘制**吸收曲线并计算表观渗透系数Papp，Papp =△Q/(△t· A·P0),△Q为**的累积转运量( ug) ;△Q/At为**转运速率( ug  min -1); po为**初始浓度(ug·mL-1) ;A为细胞单层的表面积(cm2)。

  MSN凭借其巨大的比表面积可以**提高**的口服生物利用度,而经过氨基修饰的MSN通过与胃肠道表面黏蛋白的相互黏附,更加**促进了**的吸收。同样,实验结果表明MSN和NH2-MSN在较高浓度时具有一定的细胞毒性,一方面是由于其巨大的比表面积与细胞接触时破坏细胞膜的稳定﹐另一方面可能由于制备时模板剂CTAB未能除尽而引起细胞毒性,前者在口服给药中难以避免,因为降低了比表面积也会降低与胃肠道的接触面积而降低吸收,后者可以在后续的研究中改进合成工艺来解决。

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