CRISPR/CAS9介导基因敲入，基因敲入的技术服务

基于CRISPR-Cas9的基因敲入（KI）

原理：当Cas9内切酶切割双链DNA时，同时提供一段与靶基因高度同源的DNA修复模板，生物体即可启动HDR修复路径。这段模板可以是单链DNA（ssDNA），也可以是双链DNA（dsDNA)，上面包含一段目的序列，其两侧序列与切口附近的基因组序列一致，因此可以作为同源臂将一段DNA序列精准地插入特定的基因组位点，从而实现精确的基因敲入。

CRISPR/Cas9 技术不仅可以用于基因敲除，还能高效地介导基因敲入，为基因功能研究和基因治疗开辟了新的途径。

CRISPR/Cas9 介导基因敲入的基本原理是利用 Cas9 蛋白在特定的引导 RNA（gRNA）引导下，对基因组进行切割，产生 DNA 双链断裂（DSB）。然后，通过细胞自身的修复机制，将外源基因片段插入到基因组的特定位置。

在进行基因敲入之前，需要设计合适的 gRNA 和构建敲入载体。gRNA 的设计要确保其能够准确地引导 Cas9 蛋白到目标位点进行切割。敲入载体则包含要插入的外源基因、同源臂以及必要的调控元件。同源臂与目标位点两侧的基因组序列同源，它们能够引导外源基因通过同源重组（HR）的方式准确地插入到基因组中。

将 gRNA 和敲入载体共同导入细胞中。可以通过多种方法实现导入，如电穿孔、脂质体转染、病毒载体介导等。一旦进入细胞，Cas9 蛋白在 gRNA 的引导下对基因组进行切割，细胞会启动修复机制。在存在敲入载体的情况下，同源重组机制会将外源基因整合到基因组的断裂位点。

为了筛选出成功敲入外源基因的细胞，通常会在敲入载体中携带筛选标记，如抗性基因。只有成功整合了外源基因和筛选标记的细胞才能在含有相应抗生素的培养基中存活。

对筛选得到的细胞进行鉴定是必不可少的步骤。可以通过 PCR 扩增、Southern 印迹、测序等方法来确认外源基因是否准确地插入到了目标位点。同时，还可以通过检测外源基因的表达情况来验证敲入的效果。

CRISPR/Cas9 介导基因敲入具有许多优点。它具有较高的敲入效率和准确性，能够实现对多种细胞类型和生物体的基因敲入。此外，该技术还可以同时敲入多个基因或进行复杂的基因编辑操作。

在基因功能研究中，CRISPR/Cas9 介导基因敲入可以用于构建基因过表达模型、标记特定基因或蛋白质、研究基因的调控元件等。在基因治疗方面，

然而，CRISPR/Cas9 介导基因敲入也面临一些挑战。例如，同源重组的效率可能受到细胞类型、基因位点等因素的影响，导致敲入成功率不稳定。此外，脱靶效应仍然是一个需要关注的问题，可能会导致非目标位点的基因插入或突变。

齐岳生物提供专业基因敲除细胞定制服务。我们可以根据您的需求，结合靶基因的情况，设计不同的基因敲除方案。例如，移码敲除、片段敲除、多基因敲除等。

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

请按照相关文献和相关安全规定进行操作，避免误用或滥用。