CRISPR/Cas9系统介导的地衣芽孢杆菌基因敲除，基因敲除的实验外包

基于CRISPR/Cas9的基因敲除（KO）

原理：当Cas9内切酶切割双链DNA时，细胞自身启动更具优势的NHEJ修复途径，导致切割位点产生移码突变或片段缺失，从而造成基因沉默，功能丧失，实现基因敲除。

地衣芽孢杆菌是一种重要的工业微生物，在生物制药、酶制剂生产和生物防治等领域具有广泛的应用。CRISPR/Cas9 系统的出现为地衣芽孢杆菌的基因功能研究和菌株改良提供了一种高效基因敲除方法。

首先，需要确定要敲除的目标基因。通过对地衣芽孢杆菌基因组的分析以及对其生理代谢过程的研究，选择与特定性状或功能相关的基因作为敲除目标。例如，与抗生素合成、酶活性调节或抗逆性相关的基因。

设计针对目标基因的 sgRNA（single - guide RNA）。sgRNA 能够与 Cas9 蛋白形成复合物，并引导 Cas9 蛋白特异性地识别并结合到目标基因组序列上。在设计 sgRNA 时，需要考虑其与目标基因的互补性、特异性以及避免对其他基因的非特异性结合。

接下来，将 sgRNA 和 Cas9 蛋白导入地衣芽孢杆菌细胞中。这可以通过电穿孔、原生质体转化或噬菌体介导的基因转移等方法实现。一旦进入细胞，Cas9 蛋白在 sgRNA 的引导下，对目标基因进行切割，造成 DNA 双链断裂。

细胞会通过自身的修复机制对断裂的 DNA 进行修复。非同源末端连接（NHEJ）修复机制通常会导致基因的插入或缺失，从而破坏基因的功能，实现基因敲除。为了提高基因敲除的效率，可以同时导入多个 sgRNA 或使用一些辅助手段，如提供同源修复模板来引导同源重组（HR）修复。

在完成基因敲除后，需要对菌株进行筛选和鉴定。可以通过抗性标记筛选、PCR 扩增和测序等方法来确定目标基因是否被成功敲除。同时，还需要对敲除菌株的表型进行分析，以验证基因敲除对菌株性状的影响。

例如，如果敲除的是与抗生素合成相关的基因，那么可以通过检测抗生素的产量来评估基因敲除的效果；如果敲除的是与酶活性调节相关的基因，则可以测定相应酶的活性变化。

CRISPR/Cas9 系统介导的地衣芽孢杆菌基因敲除具有许多优点。它具有较高的特异性和效率，能够快速准确地实现基因敲除。此外，该技术还可以同时敲除多个基因，便于研究基因之间的相互作用和代谢网络的调控机制。

齐岳生物提供专业基因敲除细胞定制服务。我们可以根据您的需求，结合靶基因的情况，设计不同的基因敲除方案。例如，移码敲除、片段敲除、多基因敲除等。

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