Hep G2细胞敲除PPP1R12B/KCNJ12/FGA基因，基因敲除的定制服务

齐岳生物提供专业基因敲除细胞定制服务。我们可以根据您的需求，结合靶基因的情况，设计不同的基因敲除方案。例如，移码敲除、片段敲除、多基因敲除等。

以下是一个针对 Hep G2 细胞敲除 PPP1R12B、KCNJ12、FGA 基因的方案：

一、实验准备

材料和试剂

针对 PPP1R12B、KCNJ12、FGA 基因的 sgRNA 设计与合成试剂盒。

CRISPR - Cas9 表达载体。

Hep G2 细胞株及细胞培养所需的培养基（如 MEM 培养基）、胎牛血清、胰蛋白酶等。

转染试剂（如脂质体转染试剂）。

筛选抗生素（若载体带有抗性基因）。

DNA 提取试剂盒、PCR 引物、测序试剂盒等分子生物学检测试剂。

细胞培养

将 Hep G2 细胞接种于培养瓶中，在 37°C、5% CO₂的培养箱中培养。定期更换培养基，当细胞生长至 80% - 90% 汇合度时，进行传代培养。

二、sgRNA 设计与载体构建

sgRNA 设计

分别针对 PPP1R12B、KCNJ12、FGA 基因，利用在线 sgRNA 设计工具，在基因的编码区选择合适的靶点，设计特异性的 sgRNA 序列。确保 sgRNA 能够有效引导 Cas9 蛋白对目标基因进行切割。

载体构建

将设计好的 sgRNA 序列克隆到 CRISPR - Cas9 表达载体中。构建好的载体应进行测序验证，确保 sgRNA 序列的正确性。

三、细胞转染

当 Hep G2 细胞生长至 70% - 80% 汇合度时，进行转染操作。

按照转染试剂说明书，将构建好的含有 sgRNA 的 CRISPR - Cas9 载体与转染试剂混合，形成复合物。

将复合物加入到 Hep G2 细胞培养体系中，轻轻摇匀，然后将细胞放回培养箱中继续培养。

四、筛选与鉴定基因敲除细胞

药物筛选（若载体带有抗性基因）

转染 24 - 48 小时后，向细胞培养基中加入筛选抗生素。持续培养 1 - 2 周，期间定期更换含有抗生素的培养基，以筛选出成功转染的细胞。

基因敲除鉴定

PCR 鉴定：

针对每个目标基因，设计位于敲除位点两侧的引物。

提取筛选后细胞的基因组 DNA，进行 PCR 扩增。

通过琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物，若目标基因被成功敲除，PCR 产物的大小会发生变化。

测序鉴定：

对 PCR 产物进行测序。

通过序列比对，确认目标基因是否发生了预期的突变或缺失。

五、单克隆细胞株的筛选与培养

单克隆细胞株筛选

通过有限稀释法，将筛选后的细胞稀释至合适的浓度，接种于 96 孔板中，使每个孔中尽量只有一个细胞。

培养一段时间后，在显微镜下观察并确认单克隆细胞的形成。

单克隆细胞株培养与鉴定

将单克隆细胞转移至更大的培养容器中进行扩大培养。

再次对单克隆细胞株进行基因敲除鉴定，确保目标基因的稳定敲除。

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

请按照相关文献和相关安全规定进行操作，避免误用或滥用。