单基因/多基因敲除细胞系构建基因敲除服务

齐岳生物提供专业基因敲除细胞定制服务。我们可以根据您的需求，结合靶基因的情况，设计不同的基因敲除方案。例如，移码敲除、片段敲除、多基因敲除等。

以下是一个小片段敲除的方案示例：

一、目标基因分析

1. 确定要敲除的目标基因及其在基因组中的位置。

2. 分析目标基因的功能和其在细胞生理过程中的作用，明确敲除该基因小片段的研究意义。

二、选择基因敲除技术

1. CRISPR/Cas9 系统

• 设计针对目标基因小片段两侧的 sgRNA（向导 RNA）。sgRNA 的设计需要考虑其特异性和效率，可通过在线工具进行设计并评估。

• 将设计好的 sgRNA 克隆到合适的载体中，同时载体中可包含荧光蛋白或抗性基因等标记，以便于后续筛选和鉴定。

  
  

三、细胞培养与转染

1. 选择合适的细胞系进行培养。

• 确保细胞处于良好的生长状态，根据细胞系的特点选择合适的培养基和培养条件。

2. 进行细胞转染。

• 可以采用脂质体转染、电穿孔转染等方法将构建好的 CRISPR/Cas9 载体导入细胞。

• 转染后，将细胞置于适宜的培养环境中培养，以促进基因编辑的发生。

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四、筛选与鉴定

1. 药物筛选（如果载体中含有抗性基因）。

• 在培养基中加入相应的抗生素，筛选出成功转染的细胞。

2. 基因敲除鉴定。

• PCR 鉴定：设计特异性引物，扩增包含敲除小片段的基因区域。如果小片段被成功敲除，PCR 产物的大小会发生变化。通过琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物，判断是否存在基因敲除。

• 测序鉴定：对 PCR 产物进行测序，进一步确认小片段敲除的准确性。

• 蛋白质水平鉴定（如果可行）：通过 Western blot 等方法检测目标基因编码蛋白质的表达情况，若小片段敲除导致蛋白质表达缺失或减少，可作为基因敲除成功的证据。

五、细胞株的建立与培养

1. 筛选出基因敲除成功的细胞，通过有限稀释法或其他方法将其培养成单克隆细胞株。

2. 对建立的单克隆细胞株进行进一步的鉴定和培养，确保其基因敲除状态的稳定性。

3. 定期对细胞株进行检测，观察其生长特性和基因敲除效果的稳定性。

作为一种新的基因编辑技术，CRISPR/Cas9有以下特点和优势：

1、靶向精确性更高。RNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9才会对DNA进行剪切。

2、可实现对靶基因多个位点同时敲除。

3、实验周期短，仅需2个月，节省大量时间和成本。

4、无物种限制。

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

请按照相关文献和相关安全规定进行操作，避免误用或滥用。