原理:TMB (3',3',5',5',-四甲苯联苯胺）是辣根过氧化物酶（HRP)的显色底物，HRP能催化TMB显色底物形成蓝色的阳离子产物，主要在―37Onm和 652nm有吸收峰，当加入酸终止反应后，蓝色转为黄色，可以在450nm波长下测定 OD值。

一、绘制标准曲线

称取1mg HRP固体粉末，加入 1mL ddH O，即为 1mg/mL，再分别稀释成0.0001 、 0.0002、0.0004、0.0008 、 0、0016、0.0032、0.0064、0.0128、0.0256ug/mL,分别取_10uL，加入100uLTMB显色底物，15min后加入50uL 2M H,SOs终止反应，立即测定OD450值，以HRP质量为横坐标，OD450值为纵坐标，绘制HRP酶活力标准曲线。

二、铺板、转染

三、测定细胞吞入的HRP含量

1、转染后6h后，将6孔板中的培养基吸出，取500uL DPBS沿皿壁加入到每个孔中，洗涤

细胞一次，立即吸取 2mL无FBS的 DMEM 培养基使细胞饥饿16h 。

2、事先用无 FBS 的 DMEM 配置1mg/mLHRP，并避光处理，16h后培养皿中的培养基吸出，

每孔中加入80OuL的HRP溶液置37℃，5%CO2培养箱中10min 。

3、10min后立即将上清吸取到 15mL离心管中回收，DPBS洗涤细胞一次，之后每孔中加入

200uL 胰酶，消化细胞。加入 1mL DPBS重悬细胞并转移到1.5mLEP管中，3000rpm ,4℃离心2min,重复该步一次，上清倒掉，3000rpm，4℃离心1min，将上清吸干净。4、配置裂解液，用强RIPA裂解液（ 50mM Tris-cl pH7.4，150mM Nacl，1%TritonX-100 )

中加入100×PMSF和50×PIC两种蛋白酶**剂。之后分别取50uL将细胞沉淀重悬，并放到混悬仪上 4℃裂解细胞1.5h。

5、待细胞充分裂解后14000rpm，4℃离心10min，将上清转移到新的 1.5mLEP管中。

6、取5uL细胞裂解液加入到 45uLddH :O中，稀释10，涡旋混匀后取 10uL加到96孔板中，

做3个平行样，用排枪加入100uL TMB 显色底物(TMB bufferA与 TMB bufferB等体积混合)，室温避光显色15min，加入50uL 2M H zSO4终止反应，立即用酶标仪测定OD450值。

7、根据标准曲线计算细胞吞入的HRP含量。

TMB bufferA : 500mL

NaAc·3H zO 13.6 g

Citric Acid1.6 g

30% HzO:0.3 ml

Add ddH O to 500 ml

TMB bufferA : 500mL

TMB (first dissolved in 3 ml DMSO) 0.15 g

EDTA-2Na 0.2g

Critic Acid 0.95

gGlycerol 50 ml

Add ddH 20 to 500 ml

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