同位素示踪技术在疾病机制探索中的应用

   细胞凋亡研究

  细胞凋亡是机体通过特定机制调控产生的细胞自发、程序性的死亡，它发生于胚胎发育、免疫防御等阶段，具有广泛的生物学意义。凋亡异常可诱发多种疾病，如自身免疫性疾病、**症等。多种**症的**都是通过诱导**细胞的凋亡途径（如Caspase-3、Bcl-2/xL、IAPs、MDM2-p53等凋亡通路）实现的。采用同位素示踪技术对细胞进行实时、无创的观察有助于研究疾病发生发展的机制。放射性同位素标记的细胞凋亡显像剂可与凋亡细胞特异性结合，应用于凋亡的早期检测而不受探测深度制约。在凋亡早期，细胞内会出现膜小叶和细胞内液酸化，采用18F标记2-（5-氟代戊基)-2-甲基丙二酸（ML-10），细胞凋亡时，该探针的丙二酸模体核心中的2个羧基俘获质子，使负离子分散在环状结构中，增加疏水性。已被酸化的探针进而通过疏水的羟基到达胞质，结合带负离子的蛋白质，从而富集于胞质。18F-ML-10已进入临床研究阶段，匹兹堡大学医疗中心Oborski等在已接受**的多形性成胶质细胞瘤患者体内注入18F-ML-10进行检测，结果显示体内的**细胞凋亡与该分子探针的摄取量变化相关。用于评估**前和**后早期**细胞凋亡的变化，是临床上评估新诊断患者的早期**反应的一种新方法。多种凋亡信号通路涉及Caspase-3的活化，靶向Caspase-3是凋亡显像的重要研究方向。18F-CP18包含与Caspase-3蛋白高度亲和的识别序列DEVD（Asp-Glu-Val-Asp），同时还可通过结构中的聚乙二醇链进行跨膜转运。当用细胞凋亡诱导剂处理时，体外细胞实验测定结果显示**细胞中Caspase-3依赖性摄取18F-CP18。在凋亡细胞中，活化的Caspase-3剪切PEG链使显像剂滞留在细胞内，从而显像。将18F-CP18注入非小细胞肺**小鼠模型内，PET显像后发现术后**部位出现放射性浓影，证明该显像剂可检测**症**中的早期凋亡，有希望开发成新的PET显像剂。

      除小分子探针外，蛋白多肽活性物质也是同位素标记凋亡探针的重要来源。细胞凋亡早期会出现胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，Ps）的外翻。钙依赖性磷脂结合蛋白AnnexinV与Ps具有高度亲和力（Kd=0.1nmol·L-1）。细胞凋亡时AnnexinV在钙离子存在下与外翻的Ps结合并变构为三聚体，覆盖于膜外侧的Ps上。99Tcm标记AnnexinV已成为细胞凋亡检测的常见方法。Witney等使用配体螯合物HYNIC与AnnexinV连接，在Sn2+存在下经99Tcm标记制得99Tcm-HYNIC-AnnexinV。再将该探针注入荷淋巴瘤EL-4的模型小鼠体内，结果显示**摄取量与**细胞的早期凋亡相关。99Tcm标记的SAAC-PSBP-6多肽与Ps高度亲和，研究发现对99Tcm-SAAC-PSBP-6SPECT显像可以检测****后**细胞的早期凋亡。

DNA损伤修复研究

DNA损伤是导致基因突变及转录活性异常的重要原因。机体通过DNA损伤修复（DNAdamageresponse，DDR）机制以避免细胞对DNA损伤反应异常引发的**疾病。上述过程涉及多信号通路的胞内因子表达变化，这可以为同位素示踪技术提供理想的位点。由于DDR参与**发生发展过程，利用同位素示踪技术检测DDR有助于研究**发生发展机制，并监测DNA损伤**的效果。

      DNA损伤有多种不同的形式，其中包括DNA单链断裂（DNAsingle-strandbreaks，SSBs）和DNA双链断裂（DNAdouble-strandbreaks，DSBs）。多聚（ADP-核糖）聚合酶-1（PARP-1）在细胞内主要参与DNA损伤修复、维持基因组完整性以及基因转录调节等，是DNA单链断裂损伤修复的关键位点。PARP-1识别并结合到DNA断裂处，激活并催化受体蛋白的聚ADP核糖基化，完成DNA修复工作。PARP-1是DNA损伤的主要生物标志物。Zhou等发现苯并咪唑类化合物NU1085的结构类似物可以****PARP-1，其中18F-FluorThanatrace（18F-FTT）具有**的比活力（5.5×106~1.8×107Ci·mol-1），且其IC50也相对较低[（6.3±1.3）nmol·L-1]，MDA-MB-231荷瘤模型（低PARP-1表达）及MDA-MB-468荷瘤模型（高PARP-1表达）等多种移植瘤模型动物注入探针后，PET/CT显像证明体内**组织对18F-FTT的富集程度与移植瘤模型PARP-1表达呈**相关。18F-FTT探针可以通过监测体内PARP-1水平描述DNA损伤程度。

      DSBs是较严重的DNA损伤形式，可能会引发**症等相关疾病。细胞在发生DSBs时产生应激反应，导致毛细血管共济失调突变基因产生信号级联反应。组蛋白H2AX是该级联反应的重要位点，可被共济失调突变基因磷酸化形成γH2AX。γH2AX再招募其他修复因子进行损伤修复，是DSBs的重要生物标志物，可作为检测**细胞DNA损伤修复的靶点。由于γH2AX抗体的相对分子质量较大，难以直接通过胞膜结构，通常需要用细胞穿膜肽（cellpenetratingpeptides，CPPs）TAT进行修饰。Cornelissen等次采用111In修饰anti-γH2AXTAT，并将该探针注入MDA-MB-468****移植瘤模型小鼠。SPECT结果显示，**对111In-anti-γH2AX-TAT的吸收值与DNA损伤程度**相关。这表明该核素探针可以无创性地观察**DNA损伤过程。MDA-MB-468****移植瘤小鼠的**组织在辐射（10Gy）下对89Zr-anti-γH2AX-TAT的吸收较对照组（0Gy）明显更多。2同位素示踪技术在药学研究中的应用2.1****靶点研究基于细胞或动物模型的靶向候选**的发现和筛选中，只有找到合适的靶点分子才能更好理解疾病发生发展的分子机制，研究**与靶点结构互相作用的本质，从而更加有针对性地设计和改造化合物，增加**研发的可预测性和成功率。目前已知的**靶点98%以上属于蛋白质，包括G蛋白偶联受体、酪氨酸蛋白激酶及磷酸二酯酶等。目前，尽管以RNA干扰（RNAinterference，RNAi）为代表的遗传学手段在**靶点的鉴定方面有成功的案例，但通过蛋白质芯片、同位素标记的策略以及化学蛋白质组学等技术发现及鉴定**靶点才是更加直接**的方法。其中，同位素示踪技术作为工具应用于靶点的发现是当前**研究的重要手段。ⅠA和ⅠB期的非小细胞肺**患者接受**后5年存活率分别为83%和71%，而Ⅱ期患者的存活率仅有50%，这说明中期肺**的**模式仍有较大提升空间。目前，手术**和辅助化疗仍然是**早期肺**患者的常用方法，在晚期肺****中效果**的免疫检查点**剂（如PD-1及PD-L1抗体）并未被用来**早期肺**患者，其主要原因是早期肺**组织的**微环境免疫状况尚不清楚。Lavin等收集了28名早期及晚期肺腺**患者的**样本、正常肺组织及血液，并在细胞水平上分析样品，绘制**细胞免疫组分图谱。研究人员设计出一种“条形码系统”，其可以对样本中的所有细胞类型采用不同同位素标记示踪。然后运用飞行时间质谱流式细胞术（masscytometrybytimeof-flight，CyTOF）与单细胞转录组学（single-celltranscriptomics）和肺部**的多重成像技术相结合，在单细胞水平对**细胞的免疫状况进行同时分析。

     结果显示在早期肺腺**组织周围就聚集着大量**性巨噬细胞和T细胞，同时表现出NF-κB诱导激酶（NF-κB-inducingkinase，NIK）细胞的损耗，这表明免疫细胞在**形成早期就产生功能失调。同时，还发现免疫检查点蛋白PD-1和PD-L1也已经分别出现在部分CD4+和CD8+的T淋巴细胞和巨噬细胞表面，因此，在**疾病早期使用免疫疗法有望为临床**带来新的希望。

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