一、概述

His-Tag 蛋白纯化磁珠（Magarose-IDA/NTA/TED）针对纯化 His 标签蛋白而研制的一种新型纯化介质，具有**、快速、方便等特点，可通过磁分离方式直接从生物样品中一步纯化出高纯度的目标蛋白，**地简化纯化工艺和提高纯化效率，适合科研和工业领域便捷地进行 His-tag 蛋白的纯化。对比传统的过柱层析纯化方式， Magarose NTA磁珠通过磁性分离方式纯化组氨酸标签蛋白，无需对粗蛋白样品进行多次费时费力的离心、过滤步骤，无需装柱和过柱层析，无需昂贵的柱层析设备，在1小时内便能便捷地获得高产量和高纯度的目的蛋白，且能轻松实现多样品平行处理，**提高了工作效率，大大降低了设备、时间和人工成本。

本产品系列包括镍离子（Nickel）和钴离子（Cobalt）两种金属离子螯合磁珠。它们在目标蛋白结合量及所得目标蛋白纯度上有所差异，一般推荐客户使用镍离子螯合磁珠，大多数情况下能满足客户对蛋白载量和纯度的要求；对纯度要求更高的客户推荐使用钴离子螯合磁珠。

His-Tag 蛋白纯化磁珠（Magarose-IDA/NTA/TED）磁珠广泛适用于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达的可溶性组氨酸标签蛋白以及变性蛋白的纯化。

二、产品特性

注：IDA结合容量高，耐螯合剂差；NTA结合容量较高，耐螯合剂较好；TED结合容量低，耐螯合剂**。

三、使用方法

1. 推荐的缓冲液
2. 可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

Binding Buffer: 20mM PBS, 500mM NaCl, 5~20mM咪唑, pH7.4;

Wash Buffer: 20mM PBS, 500mM NaCl, 20~100mM咪唑, pH7.4;

Elution Buffer: 20mM PBS, 500mM NaCl, 300-500mM咪唑, pH7.4;

1. 包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

Binding Buffer: 8M Urea, 50mM NaH₂PO₄, 100mM Tris·HCl, pH8.0;

Wash Buffer: 8M Urea, 50 mM NaH₂PO₄, 100 mM Tris·HCl, pH6.3;

Elution Buffer: 8 M Urea, 50 mM NaH₂PO₄, 100mM Tris·HCl, 300-500 mM 咪唑, pH4.5;

Note: Buffer 在使用前需用 0.22 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。推荐的 Buffer 体系适用于多数组氨酸标签蛋白的纯化，在 Binding Buffer 中添加一定浓度的咪唑可降低非特异性结合，提高目的蛋白的纯度。初次使用的客户可以采用推荐的缓冲液，再根据实验结果适当调整缓冲液中的咪唑浓度。

2. 样品准备

2.1组氨酸标签蛋白样品准备（在大肠杆菌下非变性条件下可溶性表达）

稀释重组表达的蛋白：每克大肠杆菌菌体加入5~10 ml binding buffer重悬。样品和binding buffer含同样浓度的咪唑可避免宿主细胞表达的含组氨酸的蛋白。同时要去除大颗粒和高浓度的螯合剂，如EDTA，组氨酸、柠檬酸等杂质，防止破坏Ni-NTA树脂。

1. 酶解：0.2 mg/ml 溶菌酶，20 μg/ml DNase，1 mM MgCl₂，1 mM PMSF（终浓度）或其他蛋白酶**剂。加入的**剂必须对磁珠无影响，4°C混匀30分钟。
2. 机械裂解：超声，均质，反复冻融等。
3. 调整裂解液的pH到7.4：不要用强碱或酸调节pH（防止沉淀）。
4. 裂解液离心：将液体转移到离心管中在室温或4°C 12000 rpm离心20 min，温度的选择取决于蛋白稳定性。
5. 收集上清准备进行后续实验，或是收集离心后的沉淀准备下一步实验。
6. 对于在酵母、昆虫及哺乳动物细胞系统中表达的蛋白，如果有大量的上清液可以用硫酸铵进行蛋白沉淀。用1X PBS透析，加入到磁珠中，如果样品中不含EDTA，组氨酸，柠檬酸等影响磁珠的成分，可直接上柱。

2.2组氨酸标签蛋白样品准备（在大肠杆菌中包涵体表达变性条件纯化）

1. 用1×PBS悬浮细胞（每ml细菌沉淀约5 ml 1× PBS），按照上面的超声条件进行实验。
2. 裂解液在12,000 rpm离心10 min收集包涵体。用1×PBS洗涤几次包涵体。
3. 用Binding/Wash buffer溶解包涵体（每ml包涵体约5 ml Buffer），并在室温下孵育30~60 min。可能需要均质或超声将沉淀完全溶解。
4. 12,000 rpm离心30 min去除剩余的不溶物。小心的将上清转移到干净的管中而不触碰下面的沉淀。

2.3组氨酸标签蛋白纯化步骤

磁珠的使用量由用户根据目标蛋白产量和磁珠载量信息计算获得，这里以获得 5-10mg目标蛋白为例：

1. 磁珠准备：将Ni-NTA磁珠充分混匀，使用移液器取2 ml 的磁珠悬浮液，（磁珠沉降体积500μl）置于离心管中，磁分离，待溶液澄清，吸弃清液，加入ddH₂O反复清洗，去除酒精。
2. 磁珠平衡：加入5 ml Binding Buffer，反复吹打5-10次，磁分离，待溶液澄清，吸弃清液，重复洗2次。
3. 磁珠与目的蛋白结合：用10 ml Binding Buffer悬浮2 g湿重菌体，进行破损和裂解后，即为目的蛋白粗样，将粗蛋白破碎液加入磁珠，颠倒混匀。室温孵育15 min（如目标蛋白不稳定，置于2-8°C下孵育30 min）。
4. 洗杂：置离心管于磁分离器，待溶液澄清，移出上清液，保留以备取样检测。向离心管中加入10 ml Wash Buffer，反复吹打5-10次，磁分离，待溶液澄清，吸取上清液，保留以备检测。重复洗杂步骤3次以上。
5. 洗脱：用户可根据需要改变洗脱体积调整目标蛋白浓度，加入2-10 ml Elution Buffer 加入到离心管中，重悬磁珠混匀，磁分离，待溶液澄清，吸取上清液，即为目的蛋白组分。重复上述步骤多次，分别收集洗脱组分并留样检测，以提高目的蛋白的回收量。
6. 磁珠后处理：加入5 ml Elution Buffer，重悬磁珠，磁分离，吸弃上清，重复该步骤2次。再用5 ml ddH₂O反复清洗3-5次。最后，加入2 ml 20%的乙醇溶液，使总体积等于初始磁珠悬浮液的体积，保存于2-8°C。
7. SDS-PAGE检测：纯化所得样品用SDS-PAGE 检测。
8. 磁珠再生：磁珠连续使用三次以上，其结合目标蛋白的能力可能会明显降低，建议进行磁珠再生处理。

Stripping Buffer: 20 mM Sodium Phosphate, 500 mM NaCl, 100 mM EDTA, pH 7.4

Washing Buffer（可选）: 0.5 M NaOH, 2 M NaCl

Recharge Buffer: 100 mM NiSO₄（该化学试剂有一定的毒性，可能造成过敏反应，使用时务必注意）以5 mL 10%（v/v）磁珠悬液为例，详细说明磁珠再生操作：

1)        将磁珠悬液磁分离，去除上清，在离心管中加入5 mL ddH₂O，重悬磁珠，磁分离去除上清液。

2)        加入5 mL Stripping Buffer，重悬磁珠，室温混旋5 min，磁分离，去除上清液。重复此步骤1次。

3)        加入5 mL ddH₂O，重悬磁珠，磁分离去除上清液，重复此步骤 2次。

4)        碱处理：加入5 mL Washing Buffer，重悬磁珠，室温旋转混合5 min，磁分离，去除上清液。加入5 mL ddH₂O，重悬磁珠，磁分离，去除上清液。重复 ddH₂O洗涤步骤3~5次，至洗涤液呈中性。

5)        加入5 mL Recharge Buffer，重悬磁珠，室温旋转混合20 min，磁性离，去除上清液。

6)        加入5 mL ddH2O，重悬磁珠，磁性离，去除上清液。重复此步骤4次以上，保证镍离子去除完全。

7)        加入2ml 20%的乙醇溶液，使总体积等于初始磁珠悬浮液的体积，保存于2-8°C。

3．注意事项

1)         磁珠使用和保存过程中应避免冷冻、干燥和高速离心等操作；

2)         使用产品前务必充分振荡使磁珠均匀悬浮；

3)         磁珠与溶液混合过程中，如果溶液粘稠无法通过翻转离心管重悬磁珠，可采用移液器反复吹吸或短时漩涡混合使磁珠充分重悬；

4)         用户可根据实际需要保留经磁性分离移去的上清液，进行取样检测，以便分析纯化过程和优化蛋白纯化流程；

5)         本产品重复使用时建议纯化同种蛋白，纯化不同蛋白时，建议使用新的磁珠，以防交叉污染；

6)        本产品需与磁性分离器配套使用；

7)        本试剂盒仅用于体外实验，不能够用于临床、**和动物体内实验等，由此产生的后果概不承担责任。