3D打印技术结合创新生物墨水材料，为打印出的细胞或组织提供更接近体内的生长环境，可应用于再生医疗和组织工程中心脏、皮肤、软骨、骨骼等组织构建；以及体外检测模型构建，来进行**代谢和筛选、化妆品检测、生物材料研发和干细胞的体外分化等研究。

在组织工程领域，传统制备方法如粒子沥滤法和冷冻干燥虽然能够制备多孔支架，但是难以**调控支架外型与内部结构。三维打印是一种增材制造方法，三维生物打印实现了细胞或生长因子和生物材料同时构建三维支架，能够控制细胞或生长因子等在三维支架内部的分布，有望**地在体外打印组织或器官。在此基础上，三维打印主要是缺乏合适的生物材料用来构建功能化生物墨水。

海藻酸盐是线性聚阴离子型多糖，来源广泛且价格低廉，主要结构单元为β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G），由于海藻酸具有**的打印性能和与钙离子快速交联成型性能，同时较好的生物相容性有利于包载细胞，海藻酸盐是生物墨水常用的材料之一。与钙离子快速结合是海藻酸盐的优点但其也存在不足，钙离子在生理环境下容易与其他单价离子发生置换，从而破坏了支架的交联结构，导致支架坍塌。海藻酸盐虽然具有较好的生物相容性，能够实现细胞的包裹和较高的存活率，但是海藻酸盐的生物活性较低，细胞难以在海藻酸盐上黏附和铺展，限制了海藻酸盐在三维生物打印中的应用。目前的研究对于改善海藻酸盐稳定性问题，主要有对海藻酸盐进行甲基丙烯酸改性或接枝多巴胺，从而实现光交联或氧化交联；而为了提高海藻酸盐的生物活性，接枝RGD蛋白序列是目前常用的方法之一，RGD能够促进细胞的黏附和铺展。

设计了电荷可调控的海藻酸盐/聚赖氨酸生物墨水，聚赖氨酸富含氨基，能够与海藻酸盐的羧基发生电荷作用。实验结果发现，聚电解质之间的电荷相互作用能够提高生物墨水的打印稳定性，实现大尺寸支架打印。另一方面，支架表面的电荷可调控性促进了细胞的黏附并实现了活性因子的负载和缓释，提高了海藻酸盐的生物活性，实现了功能化支架打印。

三维生物打印图示：

图1 A：生物墨水组成和功能化支架打印示意图；B：打印后支架在水中的稳定性表征；C：打印的大尺寸自支撑结构支架；D1，D2：打印的管状支架正面图和侧面图；D3：生物墨水搭载骨髓间充质干细胞的活死染色和细胞存活率表征。

使用聚赖氨酸与海藻酸盐混合，制备了聚电解质生物墨水（图1A），流变学表征证明小分子聚赖氨酸的加入并没有改变海藻酸盐基生物墨水的剪切稀化属性，而打印后聚赖氨酸和海藻酸盐之间的电荷相互作用提高了打印支架的稳定性（图1B）并且实现了大尺寸三维支架打印（图1C）。同时，他们尝试了使用该生物墨水打印管状支架（图1D）并包载骨髓间充质干细胞，细胞在生物墨水中的存活率较高。结果表明：基于电荷相互作用能够提高生物墨水的稳定性从而构建结构复杂的大尺寸三维支架。

三维支架理化性能表征：

打印后的支架经过交联处理能够进一步提高稳定性，如图2A，2B所示，海藻酸盐/聚赖氨酸支架相对海藻酸钙支架具有更高的含水量和孔隙率以及更缓慢的降解速率，而控制生物墨水的组分比例能够进一步调控降解速率。同时交联处理后能够调控支架的表面电荷和亲疏水性（图3A，3B），有利于生长因子的静电吸附，从而提高支架的功能性，实验结果证明可调控的支架电荷能够实现硫酸软骨素和血管内皮细胞生长因子的负载和缓慢释放（图4）。

聚赖氨酸的添加改变了打印后支架的表面电荷，他们在打印后的支架表面种植了骨髓间充质干细胞，实验证明聚赖氨酸改性的支架在表面带正电荷的情况下能够促进细胞的黏附和铺展，细胞的黏附量与海藻酸钙支架有**性差异（图5）。随后他们研究了负载硫酸软骨素或血管内皮细胞生长因子的支架是否具备应有的生物活性，实验结果证明固定的硫酸软骨素促进了干细胞成软骨基因的表达以及促进了二型胶原的大量分泌。而血管内皮细胞生长因子的缓慢释放促进了干细胞血管分化相关基因的表达（图6）。

由于电荷相互作用，海藻酸盐/聚赖氨酸生物墨水能够实现在常态下大尺寸自支撑结构三维支架的打印，而且支架在水溶液中具有很好的稳定性，包载细胞的存活率较高。进一步对支架进行交联，能够实现支架表面电荷可调控性，由于未使用钙离子作为交联剂，提高了支架长期的稳定性。基于可调控的支架表面电荷，实现了促进细胞黏附和固定各种生长因子或细胞外基质，体外细胞实验证实了固定的生长因子或细胞外基质对于干细胞基因表达的调控作用。研究者相信，使用海藻酸盐/聚赖氨酸生物墨水有利于实现大尺寸高稳定性的三维支架个性化打印，而且支架的可调控的电荷和降解性能有望将其应用于各种生长因子与细胞外基质的固定，赋予支架生物功能，从而满足不同组织的修复需求。