构建Cas9和gRNA表达载体，定制服务

构建 Cas9 和 gRNA 表达载体是进行基因编辑的关键步骤之一。以下是关于构建 Cas9 和 gRNA 表达载体的详细介绍：

一、Cas9 和 gRNA 的作用

Cas9 蛋白

Cas9 是一种核酸内切酶，来源于细菌的 CRISPR-Cas 免疫系统。在基因编辑中，Cas9 蛋白在向导 RNA（gRNA）的引导下，能够特异性地识别并切割目标 DNA 序列。

Cas9 蛋白具有两个核酸酶结构域，分别切割 DNA 的两条链，造成双链断裂（DSB）。细胞内的 DNA 修复机制会对 DSB 进行修复，从而实现对目标基因的编辑。

gRNA

gRNA 是一段短的 RNA 序列，由 crRNA（CRISPR RNA）和 tracrRNA（trans-activating crRNA）融合而成。在基因编辑中，gRNA 与 Cas9 蛋白结合，引导 Cas9 蛋白识别并切割目标 DNA 序列。

gRNA 的序列设计非常关键，它需要与目标 DNA 序列互补配对，以确保 Cas9 蛋白能够准确地切割目标位点。

二、构建 Cas9 和 gRNA 表达载体的步骤

选择合适的载体骨架

载体骨架是构建表达载体的基础，它决定了载体的复制起点、筛选标记、表达调控元件等。在选择载体骨架时，需要考虑以下因素：

复制起点：确保载体能够在宿主细胞中稳定复制。

筛选标记：便于筛选含有载体的细胞。常用的筛选标记有抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。

表达调控元件：包括启动子、增强子、终止子等，它们决定了 Cas9 和 gRNA 的表达水平和时间。

插入 Cas9 基因

Cas9 基因可以通过 PCR 扩增、合成或从现有质粒中克隆得到。将 Cas9 基因插入载体骨架中，通常需要使用合适的酶切位点和连接酶。

在插入 Cas9 基因时，需要注意其阅读框的正确性，以确保 Cas9 蛋白能够正确表达。

插入 gRNA 表达盒

gRNA 表达盒通常由启动子、gRNA 序列和终止子组成。启动子可以选择 U6 或 H1 等 RNA 聚合酶 III 启动子，它们能够高效地转录小 RNA。

gRNA 序列可以通过化学合成或体外转录得到。将 gRNA 序列插入表达盒中，通常需要使用合适的酶切位点和连接酶。

在插入 gRNA 表达盒时，需要注意其方向和位置，以确保 gRNA 能够正确表达。

验证载体构建

构建好的 Cas9 和 gRNA 表达载体需要进行验证，以确保其正确性和有效性。验证方法包括酶切分析、测序、转染细胞后检测基因编辑效果等。

齐岳生物生物提供基因敲入细胞定制服务，荧光蛋白定点敲入、蛋白标签定点敲入、基因敲入等均可实现。我们提供其定制服务，包括多种类型的细胞基因KI和全流程的服务支持。

产品：

构建慢病毒载体

慢病毒载体质粒

慢病毒载体的骨架质粒合成

构建表达载体(过表达,敲除或者敲低)

基因敲减慢病毒载体感染细胞株

慢病毒制备和导入细胞

慢病毒及稳转细胞构建

RNAi基因敲减细胞系构建服务

MicroRNA抑制表达稳转细胞系构建服务

构建慢病毒表达载体

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

请按照相关文献和相关安全规定进行操作，避免误用或滥用。